Am ersten Tag der Schlacht von Gettysburg spielte Barlow eine tragische Rolle bei einer weiteren  Niederlage des XI. Korps der Unionsarmee. Um sich in den Besitz eines kleinen Hügels zu setzen, der später unter dem Namen Barlow's Knoll bekannt wurde, ließ er seine Truppen gefährlich weit nach Norden vorstoßen und öffnete so seine rechte Flanke für den Angriff einer gegnerischen Division unter Generalmajor Jubal Anderson Early. Bei dem verzweifelten Versuch, seine flüchtenden Soldaten aufzuhalten, wurde Barlow durch einen Schuss in den linken Oberkörper schwer verwundet und fiel den Konföderierten in die Hände. Bei deren Rückzug am 4. Juli mussten sie ihren transportunfähigen Gefangenen zurücklassen.  Während Barlow sich erholte, leitete er das Rekrutierungsdepot in Springfield, Illinois.